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超声波DNA打断仪实验案例

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实验案例

现在的高通量测序平台(主要是illumina)在直接测序时只能测出200bp长度的序列,因此建库方案是将DNA .片段化为200bp,然后深度测序后,后将序列拼接。我公司自主研发的非接触聚能式超声波DNA打断仪可以在不接触样品的情况下隔着EP管将细胞DNA链至打断至200bp或是更小。

 

实验目的:将收集的细胞DNA..片段化

样品:鼠源乳腺癌细胞4T1

人源肝癌细胞HepG2

人源耐药子宫肉瘤细胞MES-SA/DX5

 

实验步骤:

  • 交联: 取1皿细胞(10 cm平皿),10 mL培养基中加入270 uL  37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%,轻轻摇匀,37℃ 孵育10 min。
  • 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。550 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。轻轻摇匀,在室温下放置5 min即可。
  •  弃净培养基,用冰冷的含1 mM  PMSF 的PBS清洗细胞2次每次5-10mL。
  •  加入3 ml冰冷的含1mM  PMSF的PBS细胞刮刀收集细胞于离心管中,用PBS清洗培养皿两次,收集到离心管中
  •  预冷后2000 rpm离心 5 min收集细胞。
  •  新鲜配置一定体积的蛋白酶抑制剂复合物和SDS Lysis Buffer充分混匀
  •  弃上清,加入一定体积含有蛋白酶抑制剂复合物SDS Lysis Buffer,重悬细胞。
  •  冰上放置10min
  •  开启冷循环泵,并降温至4℃以下。
  •  开启超声波DNA打断仪将程序调制循环模式,超声20s停10s。 
  •  启动机器至超声结束
  •  加解交联试剂65℃ 解交联4h以上,可过夜解交联
  •  将超声过的样品提取DNA. 片
  •  1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳15min
  •  拍照

人源骨肉瘤细胞U2OS

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